抑制 PPARγ Ser273 磷酸化但缺乏經典 PPARγ 激動作用的化合物已成為更安全的抗糖尿病療法。通過虛擬篩選發現了化合物10，實驗證實它是一種有效的 PPARγ 結合劑和 CDK5 介導的 PPARγ Ser273 磷酸化的體外抑制劑。
背景
噻唑烷二酮類（TZDs）PPARγ 激動劑如羅格列酮和吡格列酮是有效的降糖藥，但受副作用影響限制了它們的使用。其正向抗糖尿病作用主要是通過抑制CDK5 介導的 PPARγ Ser273 磷酸化，而副作用與經典的 PPARγ 激動有關。完全激動劑(如TZDs 1和2)激活PPARγ的機制為PPARγ配體結合域(LBD)遠端羧基末端螺旋12 (H12)組成的分子開關。通常情況下,一個TZD、羧基或配體的其他極性部分與Ser289 、His323、 His449,和Tyr473形成氫鍵,從而介導H12的穩定使其能結合H3和H11并形成共激活-結合位點的關鍵部分，稱作AF2表面。相反，部分PPARγ激動劑與PPARγ配體結合口袋的一個區域結合，這個位置遠離 H12 并激活受體變構，獨立于與H12的直接相互作用。因此，這些激動劑會有較低程度的H12穩定作用，這被認為導致輔因子的不同招募，從而影響活化受體配體復合物的轉錄譜。
阿斯利康公司通過虛擬篩選發現的化合物10在報告基因測定實驗中顯示出可忽略的PPARγ 激動。并且其藥代動力學特性與口服給藥相容，可以進行臨床前體內試驗，7天的治療表明ob/ob糖尿病小鼠模型的胰島素敏感性有所改善。
圖1. 代表性 PPARγ 配體：完全激動劑（1 和 2）、部分激動劑 (3-6) 和 PPARγ 磷酸化抑制劑 (7-9）。 圖片來源：ACS Med. Chem. Lett.
圖2.完全激動劑1(紅色，A圖)和部分激動劑6(綠色，B圖)與PPARγ LBD復合體的空間填充模型。 圖片來源：ACS Med. Chem. Lett.
研究團隊在靶點驗證實驗中，觀察到了之前發現的化合物SR1664 7在ob/ob 小鼠中不耐受，因此試圖找出結構上不相關的、具有最小的 PPARγ 激動作用的PPARγ Ser273 磷酸化抑制劑。
基于完全激動劑相互作用并穩定AF2區域而部分激動劑則沒有的假設（這導致與完全激動劑相比AF2表面構象穩定性的降低），作者進行了篩選。針對部分PPARγ激動劑4和6所占據的形狀和體積進行虛篩。這兩個配體符合不與AF2區相互作用的標準，而是占據了靠近β片的結合袋的遠端部分。此外，通過占用結合口袋的非重疊體積，它們增加了被探測口袋的體積，從而增加了潛在命中率。
虛篩在阿斯利康公司的數據集上進行，首先使用快速3D shape-based對接軟件FRED，隨后使用更準確的對接算法軟件Glide SP。由Glide分數排名結合目測檢查，選擇2943個化合物進行單次重復濃度-反應測試，使用人PPARγ時間分辨熒光能量轉移（TR-FRET）結合實驗和PPARγ報告基因激動劑實驗。
201個化合物被認為有活性（PPARγ結合親和力＜1 μM, PPARγ激動效率＜25%），命中率為7%。進一步使用內部衍生模型對物理化學和DMPK(藥物代謝和藥代動力學)特性進行計算機分析，挑選得到化合物10，其代表了一類新型的PPARγ調節劑?；衔?0對人PPARγ結合親和力為24nM，但在＜10μM的濃度下對PPARγ無激活性（表1和圖3）。
表1. PPARγ化合物的體外活性。表格來源：ACS Med. Chem. Lett.
圖3. 人PPARγ 中 10 的濃度-反應數據。圖片來源：ACS Med. Chem. Lett.
隨后團隊評估了化合物10抑制CDK5介導的全長人PPARγ Ser273磷酸化的能力?；衔?0是PPARγ Ser273磷酸化的抑制劑，且其效率大于化合物1和7（表1），化合物1則以濃度依賴性的方式抑制該活性。而在兩個單獨的體外實驗中，10被證明不抑制CDK5激酶的活性。
為了進行進一步表征，作者重新合成了10，10的體外特性與虛篩結果一致。為了進一步確證化合物10是以與其他PPARγ部分激動劑類似的方式結合，而且沒有與H12形成激動劑最常見的相互作用，作者解析了一個分辨率為2.2 的10與PPARγ結合的復合物x射線晶體結構。
令人滿意的是，對于選擇的虛篩策略，PPARγ LBD-10的復合物整體結構與對接構象一致，并且化合物10以良好的形狀互補性滿足了關鍵藥效團要素（圖4）。結構中，10結合在與H12相距較遠的位置，符合其非常低的激動劑活性水平。它還與Ser370的主鏈NH形成了氫鍵，這種相互作用被許多PPARγ部分激動劑利用。
圖4. 化合物10與PPARγ LBD的復合物晶體結構。 圖片來源：ACS Med. Chem. Lett.
與x射線晶體結構和化合物10中可忽略的PPARγ激動現象一致，沒有配體介導的H12穩定性在差異HDX-MS實驗中被發現（圖5）。與化合物10直接相連的結合域的穩定性（H3, H5的C端，β片）被觀察到，同時觀察到H2，H7和含有Ser273的H2H2 '環在更長范圍的穩定。與10相比，7誘導H2-H2'環的穩定性較差，這與其較低的pS273抑制效價相關。
圖5. 化合物10誘導的PPARγ LBD穩定性的差異HDX-MS數據。 圖片來源：ACS Med. Chem. Lett.
明確了10具有所尋找的體外特征后(即，強效的PPARγ結合，最小的PPARγ激動和抑制PPARγ Ser273磷酸化)，作者繼續在ob/ob糖尿病小鼠模型中對該化合物進行分析(圖6)。一份全面的二級藥理學分析顯示，在持續的臨床前分析中，沒有發現考慮停止臨床實驗的因素。體內藥代動力學(PK)分析(100 μmol /公斤，口服灌胃給藥)在野生型的C57 / BL6小鼠上進行,化合物表現出良好的口服生物利用度(109%)和總Cmax(167μM)和合理t1/2 (5 h)。ob / ob糖尿病老鼠研究使用兩個劑量組的化合物10和陽性對照化合物1(10和100μmol/公斤/天,口服灌胃給藥)和賦形劑對照和野生型對照。
給藥7天后，兩組均顯示預期的空腹血糖和胰島素水平正?；?，與空白組相匹配(圖6A,B)。相比之下，化合物10對葡萄糖和胰島素的影響較為溫和，只有100 μmol/kg劑量組血漿胰島素水平顯著下降，并有血糖降低的趨勢，表明胰島素敏感性整體提高。在這些條件下，1和10的耐受性都很好，不影響體重(圖6C)。
圖6. 10對ob/ob小鼠糖尿病模型的體內藥效學作用。 圖片來源：ACS Med. Chem. Lett.
結論
本文通過虛篩發現了一種新型的、高親和力的PPARγ結合劑，它具有最小的PPARγ激動作用，并顯示出對CDK5介導的獨立的全長PPARγ磷酸化的體外抑制作用?；衔?0具有可接受的體內給藥PK，在ob/ob小鼠實驗中能溫和改善胰島素敏感性，這可作為進一步開發新型胰島素增敏劑治療代謝紊亂的起點。
參考文獻
O'Mahony, Gavin & Petersen, Jens & Ek, Margareta & Rae, Rebecca & Johansson, Carina & Jianming, Liu & Prokoph, Nina & Bergstrm, Fredrik & Bamberg, Krister & Giordanetto, Fabrizio & Zarrouki, Bader & Karlsson, Daniel & Hogner, Anders. (2022). Discovery by Virtual Screening of an Inhibitor of CDK5-Mediated PPARγ Phosphorylation. ACS Medicinal Chemistry Letters. 10.1021/acsmedchemlett.1c00715.
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